Nikolajew kam zweimal als Kosmonaut zum Einsatz – im August 1962 für vier Tage an Bord von Wostok 3 und für 17 Tage zusammen mit Witali Sewastjanow im Juni 1970 an Bord von Sojus 9.
Länger als diese beiden hat kein Astro- oder Kosmonaut die Erde in einem kleinen Raumschiff umrundet. Alle weiteren Langzeitrekorde wurden an Bord von geräumigeren Raumstationen aufgestellt – von Saljut eins bis hin zur MIR-Station, auf der Waleri Poljakow 1994/1995 437 Tage am Stück verbrachte.
Beim zweiten Raumflug von Nikolajew wurde deutlich, dass nach 17 Tagen bereits eine deutliche Schwächung der Muskulatur eingetreten war. Um sie bei zukünftigen Raumflügen zu verhindern oder zumindest zu reduzieren, wurden fortan geeignete körperliche Trainingseinheiten in die Missionsplanung einbezogen.
Ein Jahr nach seinem ersten Raumflug heiratete Nikolajew seine Kosmonauten-Kollegin Walentina Tereschkowa, die wenige Monate zuvor als erste Frau ins All gestartet war. 1964 kam die gemeinsame Tochter Elena auf die Welt.
Die Ehe wurde 1982 geschieden. 2004 starb Nikolajew im Alter von 74 Jahren an Herzversagen.